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CTC基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法

一般來說，CTC測(cè)序工作流程可分為四個(gè)步驟：CTC富集，CTC分離（特別是單細(xì)胞CTC或純CTC分離），基因組或轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，測(cè)序和分析。

CTC富集

目前已經(jīng)報(bào)道了幾種用于從癌癥患者血液富集CTC成功的方法。一般來說，這幾種方法都使用了兩種策略。zui常見的策略是利用細(xì)胞表面CTC標(biāo)記物進(jìn)行富集（EPCAM +，CK +，CD44 +）或刪除其中的免疫細(xì)胞（CD45 - ）。其代表性平臺(tái)包括CellSearch，MagSweeper和GILUPI細(xì)胞收集器等。另一種富集策略是利用CTCs的大小，密度，聲學(xué)，流體力等物理特性將CTC從白細(xì)胞群體中分離出來，代表性的平臺(tái)包括ClearCell，ISET。

目前采用的CTC富集系統(tǒng)方法通常將細(xì)胞表面標(biāo)記和物理特性相結(jié)合，雖然提高了提高了CTC鑒定的效率和準(zhǔn)確性；減少了對(duì)DNA,RNA的損傷，但它們都需要至少7.5ml以上的外周血。而GILUPI細(xì)胞收集器則通過從外周血液中收集體內(nèi)的CTC來克服小血液樣本所造成的富集困難問題。

CTC分離

CTC從血液中富集后，需將零至數(shù)百個(gè)CTC從背景細(xì)胞中提取出來，科學(xué)家通常使用激光捕獲顯微切割（LCM）和流式細(xì)胞儀分析（FACS）。LCM和FACS各有各的優(yōu)缺點(diǎn)。與LCM相比，F(xiàn)ACS以高通量自動(dòng)地將具有正確標(biāo)記的特定單個(gè)細(xì)胞分離成管或孔，而LCM方法允許觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生理學(xué)，以防止可能的污染或細(xì)胞損傷。從這個(gè)系統(tǒng)分離的細(xì)胞是保持生物學(xué)特性的，并保留完整的遺傳信息，可用于測(cè)序和基因表達(dá)分類。

基因組或轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增

在從全血獲得靶細(xì)胞后，應(yīng)擴(kuò)增遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生足夠的模板以創(chuàng)建NGS文庫(kù)。對(duì)于全基因組擴(kuò)增（WGA），科學(xué)家們使用線性或基于PCR的擴(kuò)增方法；對(duì)于全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（WTA），開發(fā)諸如CEL-seq，STRT-seq和SMART-seq的方法以擴(kuò)增全轉(zhuǎn)錄組或其3'區(qū)域。大多數(shù)這些擴(kuò)增方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)試劑盒商業(yè)化。

測(cè)序和分析

獲得足夠的遺傳物質(zhì)后，NGS庫(kù)準(zhǔn)備就緒并在標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議下進(jìn)行測(cè)序。在從CTC獲得測(cè)序數(shù)據(jù)之后，zui重要的程序是在樣品制備期間評(píng)估偏差并設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)模型以處理這些偏差。

檢測(cè)腫瘤進(jìn)展期間臨床相關(guān)的基因變異

癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是臨床治療的主要挑戰(zhàn)，也是癌癥患者死亡的主要原因。與原發(fā)腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性腫瘤的癌細(xì)胞有新的體細(xì)胞變異，這增強(qiáng)了治療過程中的癌細(xì)胞逃逸性。在臨床實(shí)踐中，通常難以獲得來自轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性腫瘤的再活檢，這導(dǎo)致治療期間的模糊診斷結(jié)果。而液體活檢則通過對(duì)來自CTC的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進(jìn)行測(cè)序，使得研究人員在沒有活檢測(cè)序的情況下觀察了腫瘤譜中的體細(xì)胞變化，這成為基因測(cè)序中的一大突破。

推測(cè)腫瘤的異質(zhì)性和進(jìn)化動(dòng)態(tài)

通常癌癥被認(rèn)為是達(dá)爾文進(jìn)化的結(jié)果，因?yàn)榘┌Y在單個(gè)細(xì)胞中不斷獲得新的體細(xì)胞突變，然后經(jīng)過選擇增強(qiáng)特定惡性細(xì)胞的適應(yīng)性和生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。理解腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）和進(jìn)化對(duì)疾病復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)和癌癥的有效治療至關(guān)重要。目前有三個(gè)主要的假設(shè)模型解釋ITH，包括克隆進(jìn)化，癌癥干細(xì)胞和增變表型模型。與僅測(cè)序原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞相比，測(cè)序CTC提供了額外的數(shù)據(jù)以進(jìn)一步探索ITH的復(fù)雜性。另外，由于外周血中CTC的存活是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要步驟，所以對(duì)CTC基因組進(jìn)行測(cè)序可以描繪出更詳細(xì)的腫瘤演進(jìn)過程，有助于了解腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制。

許多CTC測(cè)序研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了CTC的遺傳異質(zhì)性，這進(jìn)一步增加了CTC癌癥生物學(xué)研究的復(fù)雜性。在CTC突變狀態(tài)中存在高的患者間和患者內(nèi)異質(zhì)性。通過檢測(cè)到的CTC體細(xì)胞核苷酸突變體（SNV）構(gòu)建腫瘤進(jìn)化過程，并繪制早期干細(xì)胞突變（腫瘤演化早期存在的突變）具有相當(dāng)大的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，由于在大多數(shù)癌癥類型中捕獲的CTC數(shù)量有限，難以分析個(gè)體患者的SNV進(jìn)化結(jié)構(gòu)。

而且，在癌癥進(jìn)化期間，拷貝數(shù)變異（CNV）也經(jīng)常改變。對(duì)癌癥治療期間這些復(fù)雜體細(xì)胞突變的生物學(xué)影響的進(jìn)一步研究將顯著促進(jìn)我們對(duì)癌癥進(jìn)展中CTC生物學(xué)的理解以及在疾病監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的未來臨床應(yīng)用。

了解腫瘤進(jìn)展期間發(fā)生改變的分子通路

以前的研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了涉及癌癥轉(zhuǎn)移的特定分子通路，如TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和EMT。然而，大多數(shù)這些研究是基于小鼠模型或特定的生物標(biāo)志物。盡管存在顯著的ITH，分析CTC基因表達(dá)為了解在轉(zhuǎn)移過程中改變的分子通路提供了一個(gè)*的窗口。單細(xì)胞RNA測(cè)序的出現(xiàn)（scRNAseq）技術(shù)也使得能夠使用有限數(shù)量的分離的CTC獲得全面的基因表達(dá)和剪接信息。因此，CTC轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)樵诎┌Y進(jìn)展期間數(shù)字化分子通路提供了*的機(jī)遇。

CTC測(cè)序的挑戰(zhàn)與未來展望

對(duì)CTC基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序面臨著巨大技術(shù)挑戰(zhàn)，獲得足夠的細(xì)胞進(jìn)行文庫(kù)制備和測(cè)序是CTC測(cè)序的*個(gè)關(guān)鍵步驟。然而，根據(jù)不同的分離方法和癌癥類型的不同研究可以得出不同的結(jié)論。通常，獲得足夠的CTC進(jìn)行測(cè)序仍然是大多數(shù)癌癥類型的重要問題，這限制了CTC測(cè)序研究的數(shù)量。此外，白細(xì)胞污染，缺乏特異性生物標(biāo)記物，低通量和耗時(shí)耗力的捕獲操作方案也阻礙了CTC測(cè)序研究的進(jìn)展。獲得高質(zhì)量測(cè)序文庫(kù)是CTC測(cè)序中的另一關(guān)鍵步驟。

更重要的是，對(duì)CTC測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析需要額外的質(zhì)量評(píng)估和評(píng)估，特別是樣本和測(cè)序文庫(kù)制備過程中引入偏差的評(píng)估。基因組擴(kuò)增期間的脫落（ADO）可能阻止檢測(cè)CTC體細(xì)胞突變等位基因， WGA方法的局限性可能導(dǎo)致基因組覆蓋率低，假陽(yáng)性率高，突變檢測(cè)的靈敏度低，WGA中的不均一讀取分布和嵌合體也可能導(dǎo)致CNV和SV中的偽影 。

隨著先進(jìn)的微流體方法的發(fā)展，一些新型的測(cè)序技術(shù)顯示出解決CTC測(cè)序技術(shù)障礙的希望。例如，科學(xué)家現(xiàn)在可以進(jìn)行原位DNA或RNA測(cè)序。這種方法降低了樣品處理過程的復(fù)雜性以及在CTC富集和分離過程中可能發(fā)生的細(xì)胞損傷或損失。此外，新興的單分子測(cè)序技術(shù)有望在不擴(kuò)增的情況下分析DNA或RNA分子。

參考文獻(xiàn)

1、Zhongyi Zhu & Si Qiu & Kang Shao & Yong Hou. Progress and challenges of sequencing and analyzing circulating tumor cells. Cell Biol Toxicol. https://doi.org/10.1007/s10565-017-9418-5.